Choroba wirusowa Ebola w Demokratycznej Republice Konga AD 2

Przypadek prawdopodobny został zdefiniowany jako jakakolwiek podejrzana sprawa oceniona przez klinicystę lub jakąkolwiek osobę, która zmarła z powodu podejrzenia o EVD i miała powiązanie epidemiologiczne z potwierdzonym przypadkiem, ale nie została przetestowana i nie uzyskała laboratoryjnego potwierdzenia choroby. Prawdopodobny lub podejrzewany przypadek został sklasyfikowany jako potwierdzony, gdy próbka od chorej osoby uzyskała pozytywny wynik testu EBOV w laboratorium. W tym badaniu ostateczna klasyfikacja pacjentów pozostawała podejrzewana lub prawdopodobna, gdy nie można było ustalić ostatecznej diagnozy (zwykle z powodu braku próbki krwi). Próbowaliśmy zidentyfikować źródło infekcji u każdego pacjenta z EVD, śledząc kontakty, głównie retrospektywnie. Próbki krwi
Pierwsze próbki pobrano od ośmiu pacjentów z objawami z podejrzeniem EVD, którzy odwiedzili ośrodek zdrowia Lokolia w prowincji Équateur. Podobnie jak we wcześniejszych wybuchach epidemii EVD, próbki krwi pobrano, za zgodą osoby chorej lub na oddziałach szpitalnych, przez zespół składający się z pracowników Ministerstwa Zdrowia w DRK i WHO.3 Próbki zostały umieszczone w suchych probówkach i natychmiast transportowany do Institut National de Recherche Biomédicale (INRB), Kinszasa, DRC, do badań laboratoryjnych i przechowywania. Próbki krwi zostały również przesłane do ośrodka referencyjnego WHO w celu diagnozy wirusowej gorączki krwotocznej, Centre International de Recherches Médicales de Franceville (CIRMF), Gabon, w celu potwierdzenia. Na wszystkich etapach podejmowano istotne środki bezpieczeństwa biologicznego w celu uniknięcia skażenia personelu i środowiska.
Testy diagnostyczne
Całkowity RNA wyekstrahowano ze 100 .l surowicy za pomocą BioRobot EZ1 i zestawu EZ1 Virus Mini Kit, wersja 2.0 (oba z Qiagen), zgodnie z instrukcjami producenta. RNA po raz pierwszy przekształcono w komplementarny DNA (cDNA) za pomocą komercyjnego zestawu (odwrotna transkrypt cDNA o dużej pojemności, Applied Biosystems) i specyficznych w czasie rzeczywistym testów odwrotnej transkryptazy-reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR). gen nukleoproteiny EBOV4 przeprowadzono na 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Cykl amplifikacji obejmował 2 minuty w 55 ° C i początkową denaturację w 95 ° C przez 10 minut, a następnie 45 cykli w 95 ° C przez 15 sekund i w 58 ° C przez minutę.
W przypadku próbek z pozytywnym wynikiem w RT-PCR, przeprowadzono test PCR ukierunkowany na fragment genu polimerazy filovirus (L) przy użyciu zestawu One-Step RT-PCR SuperScript III (Invitrogen). Reakcję przeprowadzono w końcowej objętości 25 .l, zawierającej 12,5 .l buforu 2X, 1,5 .l każdego startera (10 .M) (Filo A i Filo B), albuminy surowicy bydlęcej (1 .g na mikrolitr), .l SuperScript III Platinum Taq Mix, woda wolna od RNazy i 5 .l RNA. Amplifikacja obejmowała etap odwrotnej transkrypcji przez 30 minut w 45 ° C, po którym następowała denaturacja w 95 ° C przez 2 minuty, a następnie 45 cykli 15 sekund w 94 ° C, 30 sekund w 55 ° C i 45 sekund. w 68 ° C, z końcowym etapem elongacji wynoszącym 5 minut w temperaturze 68 ° C.
Sekwencjonowanie wirusa
Fragment PCR o długości 346 bp oczyszczono przez ultrafiltrację przed sekwencjonowaniem (Millipore). Sekwencjonowanie przeprowadzono z użyciem zestawu do sekwencjonowania cykli BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystems) i oczyszczono za pomocą strącania etanolem. Chromogramy sekwencji z obu nici uzyskano za pomocą automatycznego analizatora sekwencji (ABI 3730XL, Applied Biosystems) ze starterami PCR. W celu uzyskania pełnej charakterystyki genomowej, wirusowy RNA bezpośrednio ekstrahowano z próbek surowicy za pomocą zestawu EZ1 Viral RNA Kit (Qiagen), zgodnie z instrukcjami producenta. Ekstrahowany całkowity RNA został retrotransskrybowany do cDNA z odwrotną transkryptazą SuperScript III i losowymi starterami heksamerowymi (Life Technologies). Wytworzony cDNA amplifikowano za pomocą polimerazy Phi29, jak opisano poprzednio. 5 Amplifikowane DNA oznaczono ilościowo za pomocą zestawu do testu Quant-iT DNA (Life Technologies) i wykonano rozcieńczenie w celu uzyskania 0,2 ng zamplifikowanego DNA. na mikrolitr w ostatecznym roztworze. Bibliotekę przeprowadzono przy użyciu zestawu do próbek DNA Nextera XT (Illumina), zgodnie z instrukcjami producenta.
DNA początkowo zsekwencjonowano za pomocą sekwencera MiSeq (Illumina), po drugim przebiegu z sekwenserem Illumina NextSeq. W sumie uzyskano 5,6 × 106 odczytów dla każdej próbki. Wszystkie odczyty zostały przefiltrowane zgodnie z jakością, a te odpowiadające ludzkim genomom zostały usunięte za pomocą oprogramowania mapującego przy użyciu sekwencji hg19 Homo sapiens jako odniesienia. Odczyty wirusowe odpowiadające genomowi EBOV zostały wybrane za pomocą podejścia podobieństwa za pomocą narzędzia wyszukiwania BLASTN, odnoszącego się do pełnej sekwencji izolatu Yambuku z 1976 roku EBOV dostępnego w GenBank (numer dostępu, KC242801)
[patrz też: psychologia pracy, psycholog lublin, Psycholog Wrocław ]

Powiązane tematy z artykułem: psycholog lublin Psycholog Wrocław psychologia pracy